In unserem Labor haben wir eine breite Palette immunhistochemischer Färbungen und Spezialnachweise fest etabliert. Die Markierungen erfolgen in der Regel mit beständigen Farbmarkern wie DAB oder ImmunoGold. Fluoreszenz-Markierungen führen wir auf Wunsch ebenfalls durch, ebenso Doppel- und Dreifachmarkierungen.
Wir etablieren Nachweisreaktionen sowohl mit klassischen Farbsubstraten (z.B. DAB) als auch mit modernsten Fluoreszenzfarbstoffen Ihrer Wahl. Wir verfügen über eine langjährige Expertise in der IHC auf humanen, zoologischen und botanischen Geweben mit zahlreichen mono- und polyklonalen Antikörpern.
Durch die Reaktion des primären Antikörpers mit dem gewünschten Antigen ist der Immunnachweis noch nicht sichtbar. Im Folgenden sollen verschiedene Verfahren zur Visualisierung des Antigen-Antikörper Komplexes vorgestellt werden:
Direkte Methode
Bei der sogenannten direkten Methode ist der primäre Antikörper direkt an einen Fluoreszenzfarbstoff oder an ein Enzym, welches später einen Farbstoff umsetzt, gebunden.Bei dieser Methode ist der Hintergrund meistens relativ gering, da keine weiteren sekundären Antikörper oder andere Stoffe, die an indirekten Verfahren beteiligt sind, am Gewebe binden können.Allerdings gibt es bei der direkten Methode auch keinerlei Signalverstärkung.
Indirekte Methoden
Bei der indirekten Methode wird noch einmal zwischen der Zwei-Schritt und der Drei-Schritt-Methode unterschieden.In beiden Fällen wird der Fc-Teil des primären Antikörpers von einem sekundären Antikörper gebunden, der gegen die Spezies, aus welcher der primäre Antikörper gewonnen wurde, gerichtet ist.
Bei der Zwei-Schritt-Methode ist an diesen sekundären Antikörper ein Fluorochrom oder Goldpartikel gebunden, der direkt visualisiert werden kann.Häufig ist der sekundäre Antikörper auch mit einem Enzym (z.B.Peroxidase) konjugiert, mit dem dann wiederum ein Substrat umgesetzt werden kann.
Bei der Drei-Schritt-Methode wird an den enzymgekoppelten sekundären Antikörper noch mal ein tertiärer Antikörper mit demselben Enzym gebunden. Durch die Aufsummierung von Enzymen kommt es hier zu einer entsprechenden Signalverstärkung.Bei der indirekten Methode wird die Visualisierung also vom sekundären Antikörper und seinem Konjugat erreicht.Die Visualisierung kann hierbei direkt, d.h. ohne weitere Arbeitsschritte erfolgen (Beispiel Fluoreszenz) oder es wird in mehreren Schritten ein Farbsubstrat, z.B.3,3‘-Diaminobenzidin Tetrahydrochlorid (DAB) umgesetzt.
Die indirekte Methode bringt eine geringe (Zwei- Schritt) bis starke Signalverstärkung (Drei-Schritt), da unter anderem mehrere sekundäre Antikörper einen primären Antikörper binden können und vermehrt Fluorochrome, Goldpartikel oder Enzyme angesammelt werden.Allerdings kommt es bei der indirekten Methode auch zu mehr Hintergrund als bei der direkten Methode, da der sekundäre Antikörper auch unspezifisch an Gewebe binden kann.Dies wird durch die Verwendung von entsprechenden Normalseren vermindert.
PAP, APAAP – Methode
Die PAP Methode basiert auf einem Antikörper- Enzym-Komplex, der sich aus Peroxidase-Anti-Peroxidase und ZWEI Antikörpern zusammensetzt.Die APAAP Methode hingegen basiert auf einem Antikörper-Enzym-Komplex aus Alkalische-Phosphatase-Anti-Alkalische-Phosphatase mit nur EINEM Antikörper.Bei beiden Systemen wird der primäre Antikörper an seinem Fc-Teil mit nur einer Antikörperbindungsstelle des sekundären Antikörpers, der sich hier auch gut als Brückenantikörper begreifen lässt, gebunden.Damit nur eine Antigen-Bindungsstelle des Brückenantikörpers den Fc-Teil der primären Antikörper bindet und eine Antigen- Bindungsstellen frei bleibt, wird mit einem Überschuss an sekundärem Antikörper gearbeitet.An die noch freie zweite Bindungsstelle des sekundären Antikörpers bindet dann der Fc-Teil eines dritten Antikörpers, welcher ein Teil des PAP- oder APAAP-Komplexes ist.Die Antikörper des Komplexes müssen aus derselben Spezies stammen wie der verwendete primäre Antikörper, da sonst keine Bindung mit dem sekundären Antikörper zustande kommt.Nun kann durch die jetzt vorhandenen Enzyme Substrat umgesetzt werden.
(Strept-)Avidin-Biotin-Methoden
Biotin und Avidin haben eine sehr hohe Affinität zueinander.Dies wird in verschiedenen immunhistochemischen Methoden genutzt.Bei all diesen Methoden wird ein Biotin konjugierter sekundärer Antikörper eingesetzt.An das Biotin des Antikörpers kann nun Avidin oder auch Streptavidin binden.Zur Visualisierung können nun verschiedene Verfahren verwendet werden.Es kann ein Fluorochrom an das Avidin/Streptavidin gebunden sein, was im Gegensatz zu einem direkt an den sekundären Antikörper gebundenen Fluorochrom, zu einer Signalverstärkung führt.Das Avidin kann aber auch bereits mit einem Enzym verbunden sein (labelled avidin biotin technique, LAB), welches dann später ein Farbsubstrat umsetzt.Alternativ zu einem Fluorochrom oder einem einzelnen Enzym kann aber auch ein Komplex aus Avidin, Biotin und Enzym an das Avidin gekoppelt sein.Diese Kombination von Avidin und Biotin mit einem Enzym nennt man dann den ABC-Komplex.Auch hier kann das gebundene Enzym wiederum Farbstoff umsetzen.Die ABC-Methode bietet eine starke Signalverstärkung, da der relativ große Komplex mehr Enzympartikel tragen kann als die anderen Methoden.Dies ist bei wenig Antigen im untersuchten Gewebe durchaus von Vorteil.
Einsatz von Polymeren
Eine weitere Methode ein Antikörpersignal zu erhalten ist der Einsatz von Polymeren. Die können durchschnittlich zehn Antikörper und ungefähr 70 Enzymmoleküle binden. Polymere sind somit geeignet, das Antikörpersignal entscheidend zu verstärken. Die daraus resultierende erhöhte Empfindlichkeit beruht auf einer Reduktion der unspezifischen Bindungen. Das Hintergrundsignal ist folglich wesentlichen schwäche und diese Methode erlaubt eine Doppelfärbung zweier verschiedener Antigene gleichzeitig.